High performance liquid chromatography (HPLC) ou cromatografia a líquido de alta eficiência, em português, é um método de separação de compostos químicos em solução. Tem sido amplamente utilizado como ferramenta em várias áreas da biologia, química e no setor farmacêutico. A técnica é aplicada a análises qualitativas e quantitativas de substâncias em diferentes matrizes. Nos equipamentos de HPLC, também chamados de cromatógrafos, é possível a realização dessas análises. As qualitativas são voltadas à identificação de substâncias, enquanto nas quantitativas realiza-se a determinação do teor ou concentração de um elemento. “O método é usado para determinação da porcentagem da substância ativa, na quantificação das impurezas e na determinação da composição ou formulação de um produto, bem como no estudo de estabilidade e degradação de um composto e, em alguns casos, também para purificação de um princípio ativo”, afirma Poatã Casonato (Foto), farmacêutico industrial e diretor de relacionamento do ICTQ.
“A cromatografia a líquido de alta eficiência tem ampla aplicação na indústria farmacêutica, como doseamento de insumos farmacêuticos e de medicamentos, identificação de fármacos em diferentes produtos ou matrizes, separação e doseamento de impurezas em matérias-primas ou produtos acabados. Pode ainda ser utilizada na determinação do fármaco em testes de controle de qualidade, como dissolução e uniformidade de doses unitárias e em estudos de estabilidade para detecção e quantificação de produtos de degradação”, explica a professora Isabela da Costa César, da Faculdade de Farmácia da UFMG. A vantagem de utilizar um cromatógrafo está relacionada à seletividade e sensibilidade da técnica empregada. “Por ser um procedimento de separação, os analitos são primeiramente segregados para depois serem quantificados, o que propicia análises altamente seletivas. A sensibilidade da cromatografia a líquido de alta eficiência normalmente é superior às outras técnicas analíticas, como espectrofotometria na região do ultravioleta ou volumetria, e está relacionada ao tipo de detector acoplado ao cromatógrafo”, acrescenta a professora.
“Os sistemas de cromatografia são críticos na indústria farmacêutica”, acentua Alexandre Rosolia, especialista em cromatografia da Merck. “As aplicações se iniciam no processo de descoberta e purificação dos princípios ativos, seguindo para a verificação da performance do medicamento formulado (equivalência farmacêutica e bioequivalência), estudo de estabilidade do fármaco (o qual define seu prazo de validade), além das validações de metodologias analíticas, de processo produtivo e limpeza de equipamentos”, esclarece o especialista. Após o composto ser lançado no mercado, a cromatografia passa a ser utilizada no controle de qualidade da matéria-prima e do produto acabado.
No controle de qualidade de medicamentos, os equipamentos HPLC são utilizados para verificar se os produtos farmacêuticos estão em conformidade com as normas e diretrizes especificadas nas farmacopeias e pelos órgãos reguladores. “O HPLC se destaca no controle de qualidade de medicamentos pela alta sensibilidade, versatilidade e excelente reprodutibilidade em separações de misturas complexas, devido à alta eficiência na separação de moléculas sob pressão em uma grande área de superfície, em especial quando se utilizam colunas de cromatografia a líquido de ultraeficiência (UHPLC)”, revela Daniel Menezes Saidemberg, especialista de inteligência de mercado da Shimadzu.
Estão disponíveis no mercado equipamentos para a cromatografia a líquido convencional e para a cromatografia a líquido de ultraeficiência. “UHPLC oferece as mesmas aplicações da cromatografia convencional, mas pelo fato de utilizar colunas com menor tamanho de partícula e equipamento que suporta pressões elevadas, as análises podem ser realizadas com menor tempo de corrida, maior eficiência e menor gasto de solventes”, observa Isabela da Costa César. “Entretanto”, pondera a professora, “o preço do equipamento UHPLC e de suas colunas são mais elevados, se comparado à cromatografia convencional”. Poatã Casonato pondera que, com a evolução da técnica aliada à sua popularização, o custo em geral das máquinas de HPLC, que antes era uma barreira, vem se tornando aceitável na rotina da indústria farmacêutica. “Outro aspecto a salientar diz respeito à praticidade de execução das análises, beneficiadas pelo avanço dos softwares que são utilizados nos equipamentos”, sublinha o especialista.
Entre as maiores novidades do setor, estão disponíveis no mercado ampla variedade de colunas cromatográficas, com diferentes fases estacionárias, dimensões e tamanhos de partículas. Dentre elas, a professora da UFMG destaca a coluna de núcleo fundido, que oferece aumento da eficiência nas análises, com menor tempo.
Cada marca tem seu foco
Existem vários fornecedores e modelos de cromatógrafos disponíveis no País. Cada um tem suas características de operação e tratamento de dados. “O detector de arranjo de diodos (DAD) é mais comumente utilizado e o mais barato, se comparado ao cromatógrafo acoplado ao espectrômetro de massas, por exemplo”, diz Isabela da Costa César. Segundo a professora, o espectrômetro de massas é o detector que fornece maior seletividade e sensibilidade para as análises, permitindo a determinação de concentrações reduzidas da substância em várias matrizes complexas. Ele permite também a identificação precisa e elucidação estrutural de diferentes elementos.
A Shimadzu produz diversos tipos de equipamentos HPLC, divididos entre sistemas modulares e integrados. Segundo Daniel Menezes Saidemberg, eles se diferenciam pelas pressões de trabalho e capacidade de realizar corridas cromatográficas rápidas de UHPLC. “Para o setor farmacêutico, apresentamos uma linha de HPLCs integrados com bomba quaternária que suportam uma ampla gama de aplicações, de acordo com a escolha de detectores”, explica Saidemberg, lembrando que esses sistemas possuem como padrão um detector UV-VIS ou arranjo de fotodiodos (DAD). Mas, segundo o executivo, o sistema permite acrescentar detectores de fluorescência, índice de refração diferencial ou espalhamento de luz evaporativo (ELSD), conforme a necessidade de aplicação, que pode variar da identificação e teste de contaminantes, descoberta de novos fármacos até a determinação quantitativa na manufatura e controle de qualidade.
De acordo com Saidemberg, os sistemas desenvolvidos especialmente para atender as demandas da indústria farmacêutica possuem painel de controle com monitor sensível ao toque, permitindo que mesmo usuários com pouca experiência operem o instrumento, sendo possível executar rotinas de manutenção com simples instruções na tela do instrumento. Já os detectores UV-VIS e DAD possuem duplo controle de temperatura (na ótica e na célula de fluxo), que fornece medidas com uma linha de base estável, sem influência da flutuação da temperatura ambiente. O autoamostrador, com um ciclo de injeção de 14 segundos, maximiza o número de amostras que podem ser processadas seqüencialmente: 1.536 amostras podem ser acomodadas nas bandejas do autoamostrador. A reprodutibilidade para injeções de baixos volumes − menores que 1 µL, ampla faixa de linearidade e carryover ultrabaixo (<0,0025%) −, aumentam a confiabilidade dos resultados, especialmente para análises de amostras biológicas e análises diretas de amostras concentradas.
Saidemberg destaca, ainda, o forno de coluna versátil, com método de circulação forçada de ar que aumenta a estabilidade da temperatura da coluna. A operação de até 85 °C permite análises que necessitam altas temperaturas como, por exemplo, avaliação de açúcares. Além disso, três colunas de 300 mm de comprimento ou seis colunas de até 100 mm de comprimento podem ser acomodadas no forno. O equipamento da Shimadzu conta também com a tecnologia de controle de temperatura para sistemas de detectores óticos. Medidas com linha de base estável, praticamente sem efeito de flutuações de temperatura, garantem alta precisão de validação e testes de quantificação, revela o executivo da empresa.
Flexibilidade
Na Agilent, um dos diferenciais das suas linhas de equipamentos HPLC é a flexibilidade no fornecimento dos equipamentos. Há desde modelos mais simples, com uma bomba, um injetor e um detector, até modelos extremamente complexos como os UHPLCs 2D, preparativos e sistemas de desenvolvimento de métodos. “A empresa consegue atender tanto as necessidades mais básicas, como uma quantificação de açúcares, até a separação de anticorpos monoclonais, usados na preparação de medicamentos tipo biofármacos” revela Ivan Jonaitis, gerente de vendas da Agilent, lembrando que o cliente pode partir de um produto simples e ir aumentando sua capacidade até chegar a sistemas complexos. “Além disso, os módulos atuais são compatíveis com os mais antigos, permitindo que o cliente preserve seu investimento”, completa.
Uma das principais linhas da Agilent é baseada no conceito de simplicidade de operação e de manutenção, enfatiza Jonaitis. “Ela foi desenhada pensando na facilidade que o usuário precisa no seu dia a dia. Todas as peças consumíveis são substituídas pela frente, sem necessidade de soltar tampas ou parafusos laterais ou traseiros. Os procedimentos de substituição das peças de desgaste, como lâmpadas, selos, agulhas, estão disponíveis em videoclipes, em que o próprio cliente pode realizar com facilidade”, esclarece o executivo. Já o software próprio possui uma interface intuitiva e de fácil uso, permitindo que o usuário utilize o sistema de maneira rápida. A empresa lançou um pacote de ferramentas de criação de drivers que foi entregue aos principais fabricantes de software do mercado. Dessa forma, segundo Jonaitis, a linha pode também ser controlada por programas de terceiros disponíveis no mercado.
Em termos de rapidez de análise, a Agilent dispõe de equipamentos podem chegar a 1300 Bar a 2 ml/min ou 800 Bar a 5 ml/min. “Oferecemos colunas compatíveis com essas pressões e fluxos, para que se possa desfrutar da máxima capacidade das máquinas”, frisa Jonaitis. Para controle de temperatura, as máquinas utilizam sistema Peltier com preaquecimento de fase móvel, garantindo máxima estabilidade de tempos de retenção, segundo o gerente da Agilent, facilitando o trabalho do operador, pois as recalibrações são minimizadas. O compartimento de amostras também pode ser refrigerado para evitar sua degradação enquanto elas aguardam para serem analisadas.
Nos equipamentos há variedade de detectores, partindo do mais simples, ultravioleta, até sistemas de detecção de massas tipo quadrupolo/tempo de voo (Q-TOF). Os detectores DAD utilizam tecnologia de light-pipe, que amplifica a capacidade de detecção sem aumentar ruído de linha de base. Com isso, a sensibilidade é multiplicada em até dez vezes, segundo Jonaitis. A empresa utiliza a tecnologia I-Set (Intelligent System Emulation Tecnology). Com esse sistema o equipamento UHPLC é capaz de emular vários instrumentos do mercado. “Se um método foi desenvolvido em um sistema não Agilent, com o I-Set o cliente pode reproduzir o método no nosso equipamento e obter os mesmos resultados, sem necessidade de adaptações, apenas utilizando um clique de mouse”, diz o executivo.
Os principais modelos da Waters incluem um HPLC e um sistema UHPLC que emula um sistema HPLC. De acordo com Renan Oliveira, técnico especialista em cromatografia líquida e fluido supercrítico da Waters, o principal diferencial dos equipamentos da empresa é o volume de dispersão muito reduzido. “Quanto menor o volume de dispersão, maior será a eficiência do equipamento. A engenharia e tecnologia no desenvolvimento de um sistema de LC buscam a menor dispersão possível”, explica Oliveira. “Existem outros diferenciais, como a robustez dos equipamentos, e outros mais tecnológicos, com design diferenciado de banco ótico de detectores, algoritmos de bombeamento e ausência de pulse dumpers, resultando em um equipamento mais confiável e reprodutível”, assinala.
Destaque nos equipamentos de UHPLC da Waters são a detecção por massas com o detector QDa do tipo quadrupolo simples, lançado recentemente. As principais características desse detector são o baixo custo e a simplicidade e facilidade de operação. Outra novidade é a técnica de cromatografia de convergência ou fluido supercrítico (ultra performance convergence cromatography − UPCC). Nela, as separações são feitas utilizando CO2 ou no estado supercrítico como uma das fases móveis, trazendo uma série de vantagens, como ortogonalidade, custo, técnica verde, separações de compostos quirais. “Em geral são utilizados os mesmos tipos de detectores óticos da LC, sendo também compatíveis por detecção de massas”, diz o executivo.
Como se trata de uma técnica analítica muito precisa, os equipamentos são automatizados, em que o software controla, adquire e processa os dados. Por ser complexo, o software exige treinamento e experiência. “Um bom analista tem que entender do software, do equipamento e principalmente do fundamento que envolve a cromatografia líquida”, salienta Oliveira. Os equipamentos são compatíveis com alguns softwares de terceiros. Já as análises em LC são, em geral, um pouco demoradas devido à técnica envolvida, demandando também o uso de solvente em quantidade. “Porém, com o avanço da tecnologia e criação da ultraperformance pela Waters, foi possível diminuir o tempo de análise e também se conseguiu a economia de solventes”, afirma o especialista da empresa.
A Merck fornece, basicamente, três modelos de sistemas HPLC. O tradicional, com pressão de trabalho de até 400bar, é voltado ao mercado acadêmico e em aplicações mais simples. O sistema com pressão de trabalho de até 600bar, com baixa dispersão e alta sensibilidade, é direcionado a laboratórios de pesquisa e desenvolvimento, controle de qualidade, produtos naturais. Tem seu principal foco nas indústrias farmacêutica, cosmética, química e aplicações avançadas no mercado acadêmico. Já o sistema de ultracromatografia com pressão de trabalho de até 1.400bar é focado em pesquisas de ponta, nas quais a velocidade e a alta capacidade de separação são fatores determinantes. É voltado principalmente para as áreas de pesquisa e desenvolvimento, controle de qualidade, estabilidade e validação das indústrias farmacêuticas. “As principais inovações da cromatografia líquida são os interfaceamentos entre técnicas e a cromatografia multidimensional. A tecnologia já existe no Brasil, principalmente no meio acadêmico, e aos poucos está migrando para a área industrial’, revela Alexandre Rosolia.
De acordo com o especialista, os principais diferenciais dos sistemas da Merck incluem maior pressão de trabalho, permitindo o uso de colunas de menor tamanho de partícula e métodos mais rápidos; sistemas de baixa dispersão, possibilitando uma melhor separação entre os analitos e maior precisão dos resultados; e descontaminação do sistema de amostragem otimizado, evitando o aparecimento de picos fantasmas, com a consequente redução da necessidade de reanalisar amostras. Os sistemas permitem que o controle e processamento dos dados analíticos sejam feitos por diferentes marcas de software, “deixando o usuário dentro de sua zona de conforto com o programa que possui mais familiaridade”, diz Rosolia. “Nesses modelos, possuímos softwares que abrangem desde a simplicidade de uso, necessária no mercado acadêmico, até a complexidade e atendimento às regulações do mercado farmacêutico. Os softwares permitem comunicação com outros programas de uso comum no laboratório, como os de gerenciamento (LIMS, ERPs), validação de metodologias analíticas e outros”, afirma.
Garantia e manutenção
“Cromatógrafos exigem manutenção preventiva e eventualmente também corretiva”, assinala a professora Isabela da Costa César. Sendo assim, o sistema de garantia e manutenção é um aspecto importante a ser considerado na aquisição de um equipamento HPLC. Além da garantia de fábrica e do contrato de suporte tradicional, algumas empresas apresentam a opção de acesso remoto para manutenção, em que não é necessária a presença física de um técnico para solucionar determinado problema da máquina, agilizando o processo. “A operação dos nossos sistemas pode ser verificada a partir do smartphone, sem a necessidade de utilização de softwares especiais”, pontifica Daniel Menezes Saidemberg. “Com isso, pode-se monitorar o status do sistema e cromatogramas de qualquer localidade, além de permitir acesso ao sistema em uma área supervisionada.” Os equipamentos da Shimadzu possuem garantia básica de um ano, que pode ser estendida de acordo com a negociação.
Na Waters, as máquinas possuem garantia de um ano para compra local e 14 meses da emissão da fatura para importação, podendo ser estendida em até três anos, de acordo com as necessidades do cliente. “Os equipamentos demandam manutenção regular preventiva e para laboratórios regulados pode ser exigido, além da manutenção preventiva, uma qualificação do equipamento”, afirma Renan Oliveira. Segundo o executivo, a Waters oferece servido de assistência técnica, manutenção preventiva, corretiva e qualificação, feita por técnicos treinados na matriz da empresa, nos EUA.
A Merck oferece garantia de 24 meses aos equipamentos das linhas de cromatografia, espectrofotometria e fluorimetria. Segundo Alexandre Rosolia, a empresa possui um grupo de assessoria científica para auxiliar os usuários a operarem o equipamento. A empresa também executa o monitoramento remoto. Softwares controlam as manutenções efetuadas e têm programada neles a vida útil dos elementos de desgaste. “Dessa maneira, o usuário sabe quando vai precisar de manutenção em seu instrumento”, afirma Rosolia.
As máquinas da Agilent podem ter até cinco anos de garantia. Após esse período o cliente pode optar por chamados avulsos ou contrato de manutenção. Os cromatógrafos normalmente precisam de manutenção preventiva anual, revela Ivan Jonaitis, destacando que a empresa possui cerca de 70 técnicos espalhados pelo Brasil e mais de 2 milhões de peças em estoque para reparo para prestar assistência técnica. “Podemos também acessar a máquina remotamente e fazer reparos, ajustes, diagnósticos, sem necessidade de estar na frente do equipamento. Além disso, com o relatório gerado pelo programa, o cliente pode saber qual é o uso efetivo de cada equipamento, índice de falha, tempo ocioso, permitindo tomar decisões gerenciais como substituição da máquina, aquisição de mais unidades e realocação de instrumentos”, revela Jonaitis.
